A microscopia Raman coerente pode ser expandida por meio da fusão de instrumentos e computadores

20 de março de 2023

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por Light Publishing Center, Changchun Institute of Optics, Fine Mechanics And Physics, CAS

O espalhamento Raman é um processo de espalhamento inelástico que troca energias entre fótons e moléculas para transportar informações sobre vibrações moleculares. A microespectroscopia Raman tornou-se uma ferramenta analítica indispensável em biologia e cirurgia médica principalmente devido aos seus dois "livres": livre de rótulos e livre de fundo de água.

Esses benefícios nos permitem estudar amostras vivas sem perturbação endógena. Além disso, os picos Raman têm uma largura de banda espectral muito mais estreita do que o espectro de emissão dos corantes fluorescentes, o que permite o estudo simultâneo de várias espécies metabólicas no mesmo ambiente.

Em um novo artigo publicado na eLight, o Dr. Haonan Lin e o professor Ji-Xin Cheng, da Universidade de Boston, revisaram a combinação de instrumentação e abordagens computacionais para o espalhamento Raman coerente (CRS).

Apesar de suas vantagens significativas, uma desvantagem fundamental do espalhamento Raman reside em suas seções transversais severamente limitadas. Uma seção transversal Raman típica é de 10-30 cm2 por molécula, resultando em um tempo de integração de sinal muito longo, de segundos a minutos por ponto focal. Essa velocidade limitada torna impraticável a geração de imagens pixel a pixel de sistemas dinâmicos. Um processo óptico não linear foi introduzido para melhorar os sinais Raman de forma coerente e quebrar os limites fundamentais da seção transversal.

Com dois lasers ultrarrápidos sincronizados, sinais Raman coerentes surgiram em espalhamento Raman anti-Stokes coerente (CARS) e espalhamento Raman estimulado (SRS). No CRS, dois campos de laser interagem de forma síncrona com a molécula alvo. Quando a frequência de batimento corresponde ao modo vibracional Raman, ocorre um processo de transferência de energia amplificado coerentemente. Ele aniquila o fóton da bomba, converte-o no feixe de Stokes e gera fótons em uma nova frequência.

O CRS permitiu imagens químicas de alta velocidade com base em picos Raman intrínsecos em amostras biológicas. No entanto, as amostras biológicas são microssistemas sofisticados que consistem em vários metabólitos que geralmente têm sobreposições espectrais, especialmente na região de carbono-hidrogênio (CH).

Isso dificulta a quantificação e identificação de produtos químicos em células e tecidos usando CRS de cor única de banda estreita. Nos últimos anos, esforços significativos foram feitos para desenvolver CRS hiperespectral que produza um espectro Raman em cada pixel.

A imagem hiperespectral oferece o potencial para decifrar as informações sobre composições químicas e abundância em um ambiente complexo. No entanto, devido à alta dimensionalidade da imagem bruta, essas informações não estão prontamente disponíveis. Algoritmos são necessários para identificar os principais componentes puros e decompor mapas de concentração.

Paralelamente aos desenvolvimentos de instrumentação em CRS hiperespectral, vários métodos de unmixing de imagens hiperespectrais foram relatados. Dependendo se informações prévias são fornecidas sobre a composição de componentes puros, nós os categorizamos em métodos supervisionados ou não supervisionados.

Inovações de instrumentação levaram a geração de imagens CRS à velocidade de até 2 kHz de taxa de quadros, cobertura espectral de até 3500 cm-1 e velocidade de aquisição espectral de até 5 µs por espectro. No entanto, essas condições não podem ser realizadas simultaneamente devido ao limite físico determinado pelo limite de sensibilidade do CRS.

Por exemplo, aumentar ainda mais a velocidade irá deteriorar a relação sinal-ruído (SNR) da configuração, tornando-a inaplicável a aplicações biomédicas. Sob a restrição do fotodano, essa compensação pode ser transmitida como um espaço de design. É um hiperplano que se cruza com três eixos representando velocidade, largura de banda espectral e SNR. A otimização da instrumentação permite que o sistema alcance um ponto de condição ideal no hiperplano, mas ir além continua sendo um desafio.